neb t4 dna连接酶protocol:
1、在微型离心管(冰上)中设置以下反应：
（t4 dna连接酶应最后添加。注意：表中显示了使用1mol:3mol插入zhi定dna大小的载体的连接。）
成分
20 μl 反应
t4 dna连接酶缓冲液(10x)*
2 μl
载体dna (4 kb)
50 ng (0.020 pmol)
insert dna (1 kb)
37.5 ng (0.060 pmol)
无核酸酶水
to 20 μl
t4 dna 连接酶
1 μl
**注意：t4 dna连接酶缓冲液应在室温下解冻并重悬。
2、通过吸管上下轻轻混合反应物，并短暂地进行微量离心。
3、对于粘性（粘性）末端，在16°c下孵育过夜或室温下孵育10分钟。
4、对于钝端或单碱基悬突，在16°c下孵育过夜或室温下孵育2小时（或者，高浓度t4 dna连接酶可用于10分钟的连接）。
5、在65°c下加热灭活10分钟。
6、在冰上冷却，将1-5μl的反应转化为50μl的感受态细胞。
neb t4 dna连接酶使用时的注意事项：
1、atp 是反应中必不ke少的辅因子。这与需要 nad 作为辅因子的e. colidna 连接酶不同。
2、若需稀释 t4 dna 连接酶，推荐使用含 50% 甘油的贮存缓冲液（稀释缓冲液 a，neb #b8001s）稀释，然后于 -20℃ 贮存。如稀释后立即使用，也可以使用 1x t4 dna 连接酶反应缓冲液稀释。
3、连接反应可以在添加 1 mm atp 的四种限制性内切酶缓冲液的任何一种或在 t4 多聚核苷酸激酶（t4 pnk）缓冲液中进行。
4、室温连接。
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